La secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) ha transformado la biología moderna, permitiendo a los científicos estudiar la expresión génica de miles de células individuales simultáneamente. Esta técnica es fundamental para identificar diferentes poblaciones celulares, analizar la heterogeneidad celular y comprender la dinámica de expresión génica en tejidos complejos.
Recientemente, un grupo de investigadores del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) en Barcelona ha publicado un estudio que ofrece nuevos conocimientos sobre algunas de las limitaciones técnicas de este proceso. Estos hallazgos pueden ayudar a los científicos a abordar mejor los riesgos asociados al diseño de experimentos de scRNA-seq.
Un método comúnmente utilizado en scRNA-seq emplea un dispositivo microfluídico que genera millones de «microgotas». Cada célula se captura en una microgota individual y se somete a un perfilado bioquímico. Sin embargo, en ocasiones aleatorias, múltiples células pueden ser capturadas simultáneamente en una microgota, lo que lleva a que estas sean malinterpretadas como una sola célula, fenómeno conocido como «multiplet».
Este artefacto oculto puede distorsionar los datos y llevar a interpretaciones erróneas de los experimentos. Una estrategia para reducir el riesgo de multiplets es el «multiplexado de muestras», una técnica en la que las muestras se etiquetan con diferentes códigos de barras moleculares, permitiendo que los multiplets sean diferenciados por la presencia de múltiples códigos en la misma microgota. Aunque esta estrategia ha mejorado la eficiencia de costos y el diseño experimental, persistía la incertidumbre sobre si aún mantenía el riesgo de multiplets ocultos.
Análisis de multiplets ocultos en el multiplexado de muestras
En el estudio dirigido por Fumio Nakaki, investigador postdoctoral en el grupo Sharpe del EMBL Barcelona, se ha evaluado cuantitativamente el riesgo de tener multiplets indetectables (o «stealth») durante el multiplexado de muestras, tanto en teoría como en práctica. Este trabajo ha sido publicado en BMC Genomics.
Nakaki señala: «Nuestro objetivo es proporcionar a los investigadores un punto de referencia práctico. El multiplexado de muestras es ampliamente utilizado, pero sus limitaciones a menudo se pasan por alto. Al aclarar cómo y cuándo surgen los multiplets en condiciones multiplexadas, esperamos que este trabajo respalde un mejor diseño de estudios y una interpretación más precisa de los datos».
Para evaluar cómo el multiplexado de muestras influye en la detección de multiplets, Nakaki combinó modelado teórico con una evaluación experimental, utilizando conjuntos de datos de célula única disponibles públicamente. Derivó expresiones matemáticas para estimar las tasas de multiplet esperadas bajo diversas condiciones de entrada y validó estas predicciones contra datos reales donde las muestras individuales habían sido etiquetadas de manera única.
Comparando diferentes configuraciones de multiplexado, Nakaki demostró que, aunque esta técnica ayuda a identificar algunos tipos de multiplets, al menos un tipo de multiplet sigue siendo un problema, especialmente en condiciones donde la etiquetación de muestras fue insuficiente o la elección de herramientas de análisis resultó inadecuada. Su análisis ofrece orientación práctica sobre cómo equilibrar la entrada celular, el número de muestras y la especificidad deseada, subrayando que incluso con el multiplexado, los parámetros experimentales deben optimizarse cuidadosamente para mantener la integridad de los datos de célula única.
Más información:
Fumio Nakaki et al, Probability of stealth multiplets in sample-multiplexing for droplet-based single-cell analysis, BMC Genomics (2025). DOI: 10.1186/s12864-025-11835-z
